Hans Christian Gram e la sua colorazione
“Sono consapevole che finora è molto difettoso e imperfetto”
Hans Christian Gram riguardo al metodo di colorazione batterica da lui ideato.
Hans Christian Joachim Gram studiò botanica all’Università di Copenaghen e fu assistente dello zoologo Japetus Steenstrup (1813-1897). Il suo studio sulle piante lo introdusse ai fondamenti della farmacologia e dell’uso del microscopio. Gram entrò nella Scuola di Medicina nel 1878 e si laureò nel 1883. Egli viaggiò in tutta Europa tra il 1878 e il 1885.
I suoi primi lavori riguardarono lo studio dei globuli rossi umani. Fu tra i primi a riconoscere che i macrociti erano caratteristici dell’anemia perniciosa.
Il metodo che prende il suo nome fu sviluppato mentre lavorava con Carl Friedländer nell’obitorio dell’Ospedale cittadino di Berlino nel 1883-1884. Gram ideò la sua tecnica non tanto allo scopo di distinguere un tipo di batterio da un altro, ma per rendere i batteri più visibili nelle sezioni colorate del tessuto polmonare. Egli pubblicò il suo metodo il 15 marzo 1884 (quattro mesi dopo averlo scoperto) ed incluse nella sua breve relazione l’osservazione che il bacillo del tifo non aveva conservato la colorazione.
IL LAVORO DI GRAM
In tutto, nel suo lavoro iniziale, Gram aveva esaminato 20 casi di sezioni colorate con il suo metodo. In 19 casi, gli organismi avevano mantenuto il violetto di genziana (cioè erano gram-positivi). Nel ventesimo caso, tuttavia, gli organismi si erano decolorati! Di questo caso, Gram scrisse come segue:
“Un caso di polmonite cronica con capsula-coccus. Qui si trovano moltissimi cocchi che non si trovano nelle cellule dell’essudato. Questi decolorano molto facilmente nell’alcool e, per di più, con e senza trattamento con iodio. Da questo caso deriva gran parte delle culture del Dr. Friedlander. La maggior parte di quelli provenienti da animali iniettati ed esposti ad infezione si comportano in questo modo (topi, cavie ed un cane). Di questi, io ho studiato circa 25 casi. Di tanto in tanto, i cocchi negli animali da esperimento rimangono colorati dopo il trattamento con iodio ma non mostrano formazione di capsule; come tutti sanno, le capsule sono sempre molto difficili da dimostrare nelle preparazioni”.
Una grandissima scoperta
Cos’era successo? Nel 1884, mentre esaminava il tessuto polmonare di pazienti deceduti per polmonite, Gram aveva scoperto che alcuni coloranti venivano assunti e trattenuti in maniera preferenziale da certi tipi di cellule batteriche.
Nel primo passaggio, egli asciugava una macchia di fluido in un vetrino sopra una fiammella del bruciatore e vi versava su di essa una soluzione di violetto di genziana (detta anche ‘violetto cristallo’, “cristal violet“). Dopo aver sciacquato con acqua, aggiungeva la soluzione di Lugol – soluzione di triioduro di potassio – che agisce come un mordente per fissare il colorante. Quindi versava etanolo sopra il vetrino per lavare via il colorante. Alcuni batteri (pneumococchi) mantennero il colore (gram-positivi), mentre altre specie furono sbiancate o decolorate dall’alcool (gram-negativi). Il suo lavoro iniziale con questo processo di colorazione fu eseguito sullo “Streptococcus pneumoniae” e la “Klebsiella pneumoniae”.
successivamente…
Gram non usò una colorazione di contrasto nella sua procedura. Qualche anno dopo, il patologo tedesco Carl Weigert (1845-1904), di Francoforte, aggiunse un’ultima fase di colorazione con “safranina“. Gram stesso non usò mai il “contro-colorante” rosso per visualizzare i batteri gram-negativi.
La tecnica di colorazione che Gram sviluppò è ancora il metodo più importante per distinguere tra due principali classi di batteri. La sua scoperta avvenne durante gli anni d’oro della microbiologia clinica. In quel periodo furono inventate le “piastre di Petri“(1887, dal nome del microbiologo tedesco Julius Richard Petri), fu scoperto “agar” per solidificare i terreni di coltura (1881), e Pasteur e Koch erano al culmine delle loro prestazioni, mentre si scoprivano gli agenti eziologici di molte fastidiose malattie di quel tempo.
Il meccanismo della colorazione di Gram
I batteri Gram-positivi hanno una spessa parete cellulare a maglie fatta di peptidoglicano (50-90% della parete cellulare), che si colorano di viola, mentre i batteri Gram-negativi hanno uno strato più sottile (10% della parete cellulare), che si colorano di rosa. I batteri Gram-negativi hanno anche una membrana esterna aggiuntiva che contiene lipidi ed è separata dalla parete cellulare dallo spazio periplasmatico.
Esistono quattro passaggi di base della colorazione di Gram, che includono l’applicazione di una colorazione primaria (violetto di cristallo) a uno striscio termicamente fissato di una coltura batterica, seguita dall’aggiunta di un mordente (iodio di Gram), una rapida decolorazione con alcool o acetone, ed una contro-colorazione con safranina o fucsina basica.
UN CAMPIONE DI MODESTIA
Gram era un uomo modesto, e nella sua pubblicazione iniziale osservò:
“Ho quindi pubblicato il metodo, anche se sono consapevole che fino ad ora è molto difettoso e imperfetto; ma si spera che nelle mani di altri investigatori si rivelerà utile”.
vedi:
- https://it.wikipedia.org/wiki/Hans_Christian_Gram
- https://en.wikipedia.org/wiki/Hans_Christian_Gram
- Jay Hardy: “Gram’s Serendipitous Stain” (PDF). Retrieved 13 March 2016
- https://en.wikipedia.org/wiki/Gram_stain
- “THE GRAM STAIN AND THE ETIOLOGY OF LOBAR PNEUMONIA, AND HISTORICAL NOTE“, di ROBERT AUSTRIAN (Department of Medicine, State University of New York College of Medicine at New York City, Brooklyn, New York). Bacteriol Rev. 1960 Sep; 24(3): 261–265.
- Gram, H. C. (1884). “Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten“. Fortschritte der Medizin (in German). 2: 185–189..